Capítulo 7
Terapias na distrofia muscular de Duchenne
QUAIS OS AVANÇOS TERAPÊUTICOS NA DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE?
F. Munell Casadesús
As primeiras estratégias terapêuticas na DMD tinham como objetivo modificar os fenómenos que contribuem para a sua patogénese. A ausência de distrofina leva ao aumento da permeabilidade da membrana com entrada de cálcio, excitotoxicidade celular e lesões repetidas nas fibras musculares, o que desencadeia uma resposta inflamatória desproporcional que, por sua vez, inibe a regeneração das fibras musculares e leva à substituição progressiva do músculo por tecido fibroadiposo1-3. Embora os resultados destes tratamentos tenham tido um impacto limitado na evolução da doença, é indiscutível que um deles – os corticoides – revelou claros benefícios, retardando o aparecimento dos sintomas e inclusive prevenindo algumas das suas manifestações, como a escoliose4.
Espera-se que o maior impacto na história natural da doença seja alcançado com terapias destinadas a resolver a sua causa, a ausência de distrofina.
Devido à grande dimensão do gene, que excede em muito a capacidade dos vetores virais que podem ser utilizados com maior segurança atualmente5, a terapia de substituição génica está atrasada em relação a outras estratégias. Os primeiros modificadores genéticos foram desenhados para reparar as principais mutações causadoras de DMD, as deleções ou duplicações de um ou vários exões com perda da grelha de leitura e as mutações pontuais nonsense, as quais afetam 65 e 15% dos doentes, respetivamente5. O uso de oligonucleotídeos antisense (AON, – antisense oligoribonucleotides), para se conseguir o skipping de um ou mais exões e restaurar a grelha de leitura (terapia de skipping de exões), calcula-se que possa beneficiar até 83% dos doentes6. A tecnologia foi aperfeiçoada (através da administração e modificação química dos oligonucleotídeos) e, neste momento, já recebeu a aprovação das agências reguladoras, sendo comercializada em alguns países3. Para as mutações pontuais nonsense que originam um codão de terminação prematuro, a estratégia tem sido baseada no uso de medicamentos com atividade denominada «read-through», capazes de mascarar este codão e diminuir a sensibilidade do ribossoma, permitindo que a tradução proteica continue para além da mutação. A eficácia destes tratamentos foi demonstrada num grupo mais pequeno de doentes, o que levou à aprovação condicional por parte da Agência Europeia do Medicamento (EMA) até os ensaios estarem concluídos7.
Em relação à terapia baseada na substituição genética, foi demonstrado que, usando novos vetores (principalmente vírus adenoassociados recombinantes) e variantes de distrofina mais pequenas (minidistrofinas e microdistrofinas) que conservam as regiões funcionais essenciais, consegue-se obter uma transdução eficiente das células musculares e níveis terapêuticos da proteína no músculo esquelético. Nos primeiros doentes tratados em ensaios clínicos, foi demonstrado um aumento significativo de distrofina no músculo e uma melhoria funcional. Esperamos que os resultados possam ser replicados num maior número de doentes na fase III dos ensaios3.
QUAIS SÃO OS NOVOS CORTICOIDES USADOS NA DMD?
L. Carrera García
Nos cuidados padrão da DMD, estão incluídos os corticoides como a prednisona e o deflazacorte, os quais suprimem, de forma potente, a sinalização do fator nuclear proinflamatório NFκB (fator nuclear kappa B/fator nuclear de transcrição das cadeias leves kappa das células B ativadas). A ativação da via do NFκB é observada nos músculos dos doentes com DMD desde o nascimento, o que provoca a inflamação crónica do músculo e contribui para o aparecimento e evolução da doença8.
A vamorolona é um novo medicamento anti-inflamatório esteroide que difere dos corticosteroides clássicos pela ausência de ligação de um grupo carbonilo/hidroxilo no carbono C11. Actualmente não aprovado pelas Autoridades de Saúde em Portugal. Além da sua atividade anti-inflamatória através da supressão do NFkB, melhora a estabilização da membrana e é um antagonista do recetor dos mineralocorticoides. Ao apresentar um estado monomérico a nível do ligando/recetor, não realiza a atividade de transativação através da ligação de dímeros ligando/recetor, a qual tem estado ligada aos efeitos secundários dos corticoides tradicionais9-11. Os primeiros ensaios in vitro mostraram que a vamorolona manteve a atividade anti-inflamatória dos esteroides, sem os efeitos adversos relacionados (atraso de crescimento, lesão óssea, atrofia muscular)9,12. Nos ensaios clínicos, os doentes tratados com vamorolona não mostraram atraso de crescimento e os biomarcadores de renovação óssea indicaram um efeito reduzido na reabsorção óssea em comparação com os corticoides tradicionais. A incidência de acontecimentos adversos, no longo prazo, como síndrome de Cushing, aumento de peso, alteração do comportamento ou hirsutismo, foi muito menor do que nos doentes tratados com deflazacorte ou prednisona, com um bom perfil de segurança10-12.
As crianças com DMD tratadas com vamorolona entre 2,0 e 6,0 mg/kg/dia, administrada por via oral, apresentaram uma melhoria da função motora relativamente às crianças que não foram tratadas com corticoides e uma melhoria semelhante em magnitude àquelas associadas aos corticoides tradicionais11,12.
A nível cardíaco, o efeito antagonista do recetor mineralcorticoide da vamorolona poderia ser aplicado na DMD para tratar simultaneamente a patologia muscular e cardíaca de forma mais segura13.
Os seus resultados promissores, fazem da vamorolona um potencial candidato para substituir o tratamento-padrão com corticoides em crianças por DMD.
O QUE É TERAPIA ORIENTADA PARA MUTAÇÕES PONTUAIS NA DMD?
A. Nascimento Osorio
Em 10 a 15% dos dontes, a DMD é causada por uma mutação pontual nonsense (nonsense mutation) que origina um codão de terminação prematuro e impede a produção de distrofina14. Entre 1999 e 2003, foi descoberta uma molécula, hoje conhecida como atalureno, capaz de reconhecer o codão de terminação prematuro e reiniciar a grelha de leitura do gene da distrofina14,15. O atalureno é um tratamento oral indicado para a DMD causada por mutação sem sentido (nmDMD), em doentes ambulatórios com idade igual ou superior a cinco anos, em países como o Brasil, o Chile e a República da Coreia16. Mais recentemente, a indicação foi alargada para incluir doentes com dois anos de idade ou mais velhos nos Estados-Membros da UE, Islândia, Israel, Liechtenstein e Noruega16. Este tratamento não é comercializado em Espanha. Têm sido realizados vários estudos e ensaios para demonstrar a sua eficácia. Após o ensaio aberto de fase IIa, em que se demonstrou o aumento da expressão da distrofina em doentes com nmDMD tratados com atalureno17, prosseguiu-se para os ensaios nas fases IIb15 e fase III, ambos aleatórios, em dupla ocultação e controlados com placebo18, para avaliar o atalureno nos doentes com nmDMD. Estes ensaios mostraram um benefício do atalureno (40 mg/kg por dia) num subgrupo de doentes (nos que caminhavam entre 300-400 metros no teste dos seis minutos de marcha, no início do ensaio), quando comparados com os que tomaram o placebo, numa variedade de critérios de avaliação funcionais, tendo-se observado um atraso na evolução da doença, embora os ensaios não tenham atingido seu objetivo principal na população total do ensaio15,18.
Em 2020, foram publicados os dados do estudo STRIDE. Trata-se de um registo observacional internacional para avaliar a segurança e eficácia do atalureno nos países onde o seu uso está aprovado. Foi feita uma comparação de 181 doentes do STRIDE que receberam o atalureno com os dados do CINRG (Cooperative International Neuromuscular Research Group [CINRG] Duchenne Natural History)7,19,20. Foi utilizada a metodologia propensity para identificar no CINRG uma população com caraterísticas comparáveis, tendo em conta a idade em que se iniciaram os corticoides, duração do uso do deflazacorte, duração do uso de outros corticoides e idade dos primeiros sintomas7. Estudos estatísticos mostraram que os doentes que receberam o atalureno tiveram um atraso significativo na perda da ambulação e noutras funções motoras. Além disso, o atalureno foi bem tolerado, tendo um perfil risco/benefício favorável e consistente com o mostrado nos ensaios clínicos anteriores7. É importante salientar que o objetivo do tratamento com atalureno não é curar a doença, mas atrasar a sua evolução.
TERAPIA DE Exão SKIPPING E DMD
C.I. Ortez González
O princípio básico da terapia de skipping de exões é ligar um exão a montante e um exão a jusante à deleção do gene a nível do RNA do mensageiro (mRNA) e assim continuar a grelha de leitura e conseguir obter a expressão da distrofina21.
A grelha de leitura pode ser artificialmente restaurada, eliminando um ou mais exões do mRNA antes ou depois da deleção, de forma a que as instruções para a produção de distrofina conduzam a uma proteína, pelo menos, parcialmente funcional, reduzindo assim a gravidade das consequências da doença.
Como este mRNA é mais curto do que o normal, a proteína da distrofina é também mais curta, contendo menos aminoácidos. Se os aminoácidos em falta fizerem parte de regiões não-essenciais da distrofina, isso resultará numa proteína mais curta que, muitas vezes, ainda pode desempenhar o seu papel estabilizador na membrana da célula muscular. O resultado seria uma alteração dos sintomas graves de DMD para sintomas mais leves de DMB22,23.
O gene, mesmo com a sua mutação, não é alterado pelo skipping de exões, mas o seu mRNA já não contém a informação errada do(s) exão ou exões omitidos.
O componente químico utilizado para este fim são os AON, ácidos nucleicos sintéticos curtos (~20 bases) concebidos para hibridizar com sequências complementares de pré-mRNA. Estão atualmente em curso vários ensaios clínicos (skipping de exões 51, 53, 45) e algumas das moléculas ensaiadas já foram aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA). Contudo, estão, neste momento, à espera da aprovação por parte da EMA. As deleções que beneficiam da terapia de skipping de exões e os ensaios clínicos atualmente em curso são os seguintes:
Um dos inconvenientes da terapia de skipping de exões com AON é a curta eficácia (requer administração regular, pelo menos, de 15 em 15 dias, por via intravenosa) e a má retenção em órgãos vitais como o coração24,25.
AVANÇOS NA TERAPIA genética E DMD
S.I. Pascual Pascual e M. García Romero
A terapia genética na DMD envolve a substituição do gene defeituoso por um gene saudável que é introduzido através de um vetor viral26,27. Os ensaios com vetores virais para efeitos terapêuticos começaram em 1998.
O primeiro tratamento genético aprovado em humanos para uma doença foi a amaurose congénita de Leber, pela FDA, em 2018. O tratamento é infundido localmente na retina28,29.
Contudo, a DMD apresenta vários problemas30,31:
O gene da distrofina tem 2,6 megabases de tamanho e codifica 79 exões. Transcreve um mRNA de 11,5 kb e faz a transdução de uma proteína de 427 kD. Este gene é extremamente grande para ser inserido e não cabe no genoma do vírus adenoassociado (AAV) que tem uma capacidade não superior a 5 kb. Este facto levou a ponderar a introdução de um gene de minidistrofina que permita manter a grelha de leitura e gerar uma proteína parcialmente funcional, ou seja, uma proteína que contenha os domínios essenciais do gene. Que partes do gene são os componentes essenciais para a proteína é uma questão que ainda não foi totalmente resolvida. Parecem ser partes essenciais do mesmo domínio N-terminal, o domínio rico em cisteína e algumas repetições do domínio rod. No entanto, o domínio carboxi-terminal não parece sê-lo, pelo menos, para o músculo esquelético. No músculo cardíaco, há evidências de que a inclusão do C-terminal na minidistrofina pode ser mais importante. Há, pelo menos, três minidistrofinas diferentes usadas nos ensaios humanos.
Os vetores escolhidos são AAV, os quais não causam doença humana significativa e não integram o material genético cromossómico. Diferentes serotipos de AAV têm demonstrado um tropismo tecidual diferente. No caso dos neurónios motores espinhais, as células mais afetadas na atrofia muscular espinhal, o AAV-9 mostrou maior eficácia e segurança na introdução do gene SMN1 delecionado ou mutado e já foi aprovado para efeitos de tratamento pela FDA e pela EMA (Zolgensma®). No caso da DMD, os ensaios clínicos aprovados usam o AAV-9 e o AAV-rh74, um vírus muito semelhante ao AAV-8.
A questão da dose a ser administrada é importante, uma vez que os efeitos adversos resultantes da resposta imunitária do organismo são em proporção desta. A baixa carga viral parece não produzir uma resposta imunitária, mas é necessária uma dose mínima para se conseguir uma eficácia funcional. A presença de anticorpos anti-AAV antes do tratamento limita a eficácia, pelo que, enquanto não se encontra uma maneira de alterar este facto, estes doentes são excluídos do tratamento.
Existem atualmente três ensaios clínicos de minidistrofinas na DMD, tanto em crianças em ambulatório como em não-ambulatório. Até ao momento, não existem dados publicados sobre a magnitude da resposta ou sobre a duração do efeito. Também parece claro que a duração do efeito é temporária e que são necessárias novas doses para manter o efeito durante um longo período de tempo.
Outras alternativas de tratamento genético incluem a inclusão de genes que substituem a função da distrofina.
É o caso do gene GALGT2, que codifica uma O-manosiltransferase que faz a glicosilação de vários genes e proteínas, como a utrofina, a plectina, a agrina e as lamininas. Está localizado especialmente na junção neuromuscular e nos tendões, como a utrofina. Esta enzima é necessária para a glicosilação na placa motora e na junção musculotendinosa, onde a utrofina substitui a distrofina no complexo proteico associado aos distroglicanos. A inserção do gene exógeno GALGT2, através de um vetor viral, desencadeia a glicosilação do distroglicano e a superexpressão da utrofina em toda a fibra muscular, o que fez melhorar a força muscular no modelo murino32. Um ensaio em humanos (NCT03333590), fases I e II, está em curso. Há também dados no modelo murino mdx sobre a sua utilidade na cardiomiopatia distrofinopática33.
Outra abordagem promissora é a introdução, através de um vetor viral, de pequenos fragmentos de RNA nuclear não codificante (U7s-nRNA) com sequências antisense dirigidas a partes do exão alvo que induzem o skipping de exões, com resultados promissores em modelos animais34. Existe um ensaio clínico em curso (NCT04240314).
Edição genómica
Avanços recentes em edição genómica, como os sistemas CRISPR/Cas9, mostram resultados promissores em modelos murinos e caninos de DMD. Muitos estudos confirmam isso35. O CRISPR/Cas9 com RNA guia (gRNA), com atividade de endonuclease, produz cortes específicos de um ou mais exões com a intenção de recuperar a grelha de leitura do gene da distrofina, produzindo distrofina parcialmente funcional.
A ideia tem origem da experiência dos AON usados nos últimos 10 anos. Os sistemas CRISPR/Cas9 são introduzidos usando vetores virais ou nãovirais. A investigação, até ao momento, tem usado principalmente um vetor viral, o AAV.
As vantagens do CRISPR/Cas9 na terapia com AON são o facto de não necessitar de tratamento repetido, uma vez que a modificação persiste nas células, assim como o facto de gerar uma maior proporção de fibras musculares que conseguem expressar a distrofina e a quantidade desta em cada fibra, com base nos dados do modelo canino36.
Teoricamente, esta metodologia permitiria selecionar a excisão do gene da distrofina, de forma a permitir recuperar proteína parcialmente funcional numa elevada proporção de doentes com DMD. Pode permitir a deleção ou a inserção de múltiplos exões, com apenas alguns gRNA. A quantidade de proteínas Cas9 de origem bacteriana, que deve ser transportada para permitir a correção de diferentes deleções, choca com a limitação do tamanho a ser transportado pelo vetor AAV.
As possíveis respostas imunitárias iniciais e no longo prazo, bem como a garantia de não ocorrerem efeitos adversos devido à instabilidade genómica, são os outros aspetos a serem estudados nos próximos anos.
Manipulação epigenética
A proteína Cas9 cataliticamente inativa tem também sido utilizada na regulação epigenética de proteínas que melhoram a estabilidade do sarcolema, como a utrofina ou a laminina alfa-1. Aumentar estas proteínas, que não são naturalmente expressas na fibra muscular adulta, pode melhorar a força muscular37.
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